PCR(Reazione
a catena Della Polimerasi)
Priorità
bassa
Ora
che avete imparato che il DNA è il materiale
genetico di vita, esaminiamo alcune tecnologie prevalenti
nel campo della genetica.
Una
di queste tecniche è reazione a catena della
polimerasi o PCR. PCR è una tecnica ingenious
che permette che gli scienziati amplifichino milioni
di specific di sequenza del DNA di periodi nelle ore
giuste. Con questa tecnica, un campione molto piccolo
di DNA puòb sufficientemente essere moltiplicato
in moda da potergli usare abbastanza di per la prova
come nell'impronta digitale del DNA. La tecnica che
è stata inventata dal Dott premiato Kary Mullis
del vincitore Nobel in 1983 ha rivoluzionato molte
zone di ricerca genetica. PCR può essere usato
per identificare con molto una alto-probabilità,
malattia-causando i virus e/o i batteri, una persona
defunta, o un sospetto criminale.
[
per per usare PCR, uno deve già conoscere le
sequenze esatte che fiancheggiano (bugia da qualsiasi
lato di) entrambe le conclusioni di data regione di
interesse in DNA (può essere un gene o tutta
la sequenza). Uno non deve conoscere nel fratempo
la sequenza del DNA. Costruzione ostruisca le sequenze
(sequenze del nucleotide) di molti dei geni e le regioni
fiancheggianti dei geni di molti organismi differenti
sono conosciute. Egualmente sappiamo che il DNA degli
organismi differenti è differente (mentre alcuni
geni possono essere gli stessi, o molto simile fra
gli organismi, là sempre sarà geni di
cui le sequenze del DNA differiscono da fra gli organismi
differenti - al contrario, sia lo stesso organismo
(e.g.lo stesso virus, lo stesso batterio, un gemello
identico; quindi, identificando i geni che sono differenti
e quindi unico, uno può usare queste informazioni
per identificare un organismo).
Ricordi
che un gene costruzione-ostruisce la sequenza è
l'ordine preciso dell'apparenza, una dopo l'altro,
di 4 componenti differenti (deoxyribonucleotides)
all'interno di una stirata di DNA (acido deoxyribonucleic).
I 4 componenti sono: Adenina, timidina, citosina e
guanina, abbreviata come: A, T, C e G, rispettivamente
(un alfabeto 4-letter). La disposizione delle lettere
(una dopo l'altra) di questo alfabeto 4-letter genera
" una frase " (una sequenza del gene). Il
numero di lettere nella frase può essere relativamente
poco, o relativamente molti, secondo il gene. Se la
frase è 1000 lettera-lunghi, la sequenza si
direbbe per essere 1 kilobase (1000 basi).
Come
esempio: ATATCGGGTTAACCCCGGTATGTACGCTA rappresenterebbe
una parte di un gene. Il DNA è double-stranded
(tranne in alcuni virus) ed i due fili accoppiano
tra loro in un modo molto preciso. OGNI lettera in
un filo accoppierà con soltanto un genere di
lettera attraverso da esso nel filo avversario: Accoppia
SEMPRE con la T; e, la C accoppia SEMPRE con il G
attraverso i due fili.
Così:
TTAACGGGGCCCTTTAAA........TTTAAACCCGGGTTT
Accoppierebbe
con: AATTGCCCCGGGAAATTT........AAATTTGGGCCCAAA
Ora, diciamo che le suddette sequenze " fiancheggiano
" (sia su la una
o la altra conclusione di..il gene, cui include una
stirata lunga delle lettere indicate come:.............
Questi sono conosciuti, assolutamente identificato
per essere, la
sequenza delle lettere che fiancheggiano SOLTANTO
una regione
particolare del DNA dell'organismo particolare e DNA
di NESSUN ALTRO
ORGANISMO. Questa regione sarebbe una sequenza dell'obiettivo
per PCR.
Il
primo punto per PCR sarebbe sintetizza " gli
iniettori " di circa 20 lettera-lunghi, per mezzo
ciascuna delle 4 lettere e di un macchina che può
collegare insieme le lettere nell'ordine voluto -
questo punto è fatto facilmente, aggiungendo
un lettera-$$$-un-tempo alla macchina (sintetizzatore
del DNA). In questo esempio, gli iniettori che desideriamo
fare saranno esattamente gli stessi delle sequenze
fiancheggianti indicate sopra. Facciamo UN iniettore
esattamente come la sequenza a mano sinistra più
bassa ed UN iniettore esattamente come la sequenza
destra superiore, per generare:
TTAACGGGGCCCTTTAAA........TTTAAACCCGGGTTT
AATTGCCCCGGGAAATTT.......................> e: <.....................................................TTTAAACCCGGGTTT
AATTGCCCCGGGAAATTT........AAATTTGGGCCCAAA
Se
guardate questa disposizione, potete vedere che se
la sequenza a
mano sinistra più bassa dell'iniettore (corsivo)
accoppiata al filo
superiore potesse essere estendere alla destra nel
senso della freccia
e la sequenza destra superiore accoppiata al filo
più basso potesse
essere estendere alla parte di sinistra nel senso
della freccia (che
si ricorda di quella.<End of Translation>
........ also represent letters, and opposite pairing
will ALWAYS be A to T and C to G), one could successfully
exactly duplicate the original gene's entire sequence.
Now there would be four strands, where originally
there were only two. If one leaves everything in there,
and repeats the procedure, now there will be eight
strands, do again - now 16, etc.. therefore, about
20 cycles will theoretically produce approximately
one-million copies of the original sequences (2 raised
to the 20th power).
Thus,
with this amplification potential, there is enough
DNA in one-tenth of one-millionth of a liter (0.1
microliter) of human saliva (contains a small number
of shed epithelial cells), to use the PCR system to
identify a genetic sequence as having come from a
human being! Consequently, only a very tiny amount
of an organism's DNA need be available originally.
Enough DNA is present in an insect trapped within
80 million year-old amber (fossilized pine resin)
to amplify by this technique! Scientists have used
primers which represent present-day insect's DNA,
to do these amplifications.]
Punti
Di Pcr
Qui
è come PCR è effettuato:
Primo
punto: il DNA sconosciuto è riscaldato, che
induce i fili
accoppiati a separare (singoli fili ora accessibili
a primers)
Picture reproduced with permission from
http://allserv.rug.ac.be/~avierstr/principles/pcr.html
Secondo
punto: aggiunga il grande eccesso di iniettori riguardante
la
quantità di DNA che è amplificato e
che raffreddi la miscela di
reazione per permettere che i doppio-fili formino
ancora (a causa di
grande eccesso di iniettori, i due fili si legheranno
sempre agli
iniettori, anziché con a vicenda).
Picture
reproduced with permission from
http://allserv.rug.ac.be/~avierstr/principles/pcr.html
Terzo
punto: ad una miscela di tutte e 4 le diverse lettere
(deoxyribonucleotides), aggiunga un enzima che può
" colto " " la
frase " del filo avversario ed estendere "
la frase " dell'iniettore " agganciando
" le lettere insieme nell'ordine in cui accoppiano
attraverso l'un l'altro - A:t e C:g. Questo enzima
particolare è chiamato una polimerasi del DNA
(perché polimeri del DNA di marche). Un tale
enzima usato in PCR è chiamato la polimerasi
del Taq (originalmente isolata da un batterio che
può vivere in molle calde - quindi, può
sostenere la temperatura elevata necessaria per la
separazione del DNA-filo e può essere lasciato
nella reazione). Ora, abbiamo l'enzima che sintetizziamo
il nuovo DNA nei sensi opposti - MA SOLTANTO in QUESTA
REGIONE PARTICOLARE DI DNA.
Picture
reproduced with permission from
http://allserv.rug.ac.be/~avierstr/principles/pcr.html
Dopo
un ciclo, aggiunga più iniettori, aggiunga
la miscela 4-letter e ripeti il ciclo. Gli iniettori
si legheranno " alle vecchie " sequenze
così come alle sequenze nuovo-sintetizzate.
L'enzima estenderà ancora le frasi più
supereleganti... Per concludere, ci sarà ABBONDANZA
di DNA - e TUTTO L' ESSO sarà copie appena
di questa regione particolare. Di conseguenza, usando
gli iniettori differenti che rappresentano le regioni
fiancheggianti dei geni differenti di vari organismi
negli esperimenti SEPARATI, si può determinare
se infatti, del DNA è stato amplificato. Se
non ha, quindi gli iniettori non si sono legati al
DNA del campione ed è quindi altamente improbabile
che il DNA di un organismo che un dato insieme degli
iniettori rappresenta, sia presente. D' altra parte,
l'apparenza di DNA da PCR permetterà l'identificazione
precisa della sorgente del materiale amplificato.
Scattisi
qui per vedere una sequenza illustrata interattiva
semplificata di PCR
La
sezione di materiale fra le parentesi [ ] ha riprodotto
con
permesso da John (Jack) C. Colore marrone, il professor,
reparto delle scienze biologiche
molecolari, università di Kansas, Lawrence,
Kansas.
