Notas: Tecnología del DNA II

"Más Materia Tecnológica"

Bacterias y el método de plásmida

1. aislar la plásmida y el DNA que contiene el gen de interés

2. la plásmida y el gen de interés dirigidos con un alguna enzima

3. el gen se mezcla con la plásmida cortada

4. la ligasa ensambla fragmentos permanentemente

5. plásmida alterada se introduce en la célula

6. e.g. si lac Z se interrumpe entonces no habrá ningúna beta-galactosidasa; así un color blanco porque X-galón no se hiende

7. e.g. si lac Z no se rompe entonces esas colonias bacterianas serán azul es, significando la presencia del producto hendido

Las Fuentes de Genes

Una genoteca genómica es un conjunto de millares de segmentos del DNA de un genomo, cada uno llevado por una plásmida o un fago

• Clonación al azar es el muestreo al azar de un genomo. Se llama " al azar " porque no se apunta ningún gen para la reproducción

• Cómo hacer DCNcA que (complementario) no tiene intrones así que bacterias puedan expresar mejor estos genes

  1. transcripción en la célula
  2. el hnRNA que procesaba (véase los espliceosomas) convirtido al mRNA
  3. el mRNA se aisla de la célula y del reverse transcriptase (DNA-polimerasa dirigida por RNA) se agrega
  4. El hilo de DCNcA se sintetiza y mRNA degradado
  5. 2do Hilo de la DNA sintetizado usando la polimerasa de la DNA

• DCNcA tiene el potencial de ser transcrito y traducido por bacteria PERO no hay secuencias de control para la transcripción y la traducción asociadas normalmente a este gene (por lo tanto no es idéntico)

• La producción de DCNcA también rinde genotecas inexactas porque el mRNA no se puede aislar de el resto de mRNA en la célula

Insertar el DNA

El método depende del vector y del tipo de célula hospedadora.

1. Electroporación: un pulso eléctrico abreviado aplicó causa que formen agujeros membraneous temporales (a menudo poros) entre los cuales puede entrar el DNA.
2. Inyección directa de DNA en una sola célula eucariota por una agujaa microscópicamente pequeña
3. "Arma de DNA": partículas metálicas minúsculas se disparan en una colonia de células

• lo más común es la transformación bacteriana
• si se utiliza un fago el rDNA se empaqueta en la capa de la proteína y se inyecta en bacterias
• la levadura se puede inducir a llevar plásmidas y tambien los hilos lineares de DNA (al igual que otras células eucariotas)

Seleccionar un Gen de Interés

Si los clones en la genoteca de DCNcA realmente traducen el gen(s) a una proteina(s) entonces es posible cribar todos los clones para la presencia de esas proteinas

• Detección de la proteína: basada en actividad (si es una enzima) o la estructura usando anticuerpos para pegar a ella
  sin embargo, las técnicas de cribado suelen depender en la detección del gen, en vez de su producto
• Cribado directo del gen: depende del apareamiento de bases entre el gen y el complementario en otra molécula del ácido nucleico (se llama hibridación)

Hibridación

la molécula complementaria se llama la sonda y es DNA o RNA

• cómo las puntas de prueba pueden ser sintetizadas
  1. pueden ser clasificadas por talla y dimensión de una variable con el uso de laseres múltiples y del software de alta tecnología, entonces se reproducen por PCR (la reacción en cadena de la polimerasa, vea abajo)
  2. si se sabe la secuencia del aminoácido (o dirija), las sondas pueden químicamente ser sintetizadas
• la hibridación puede dar informacion sobre relaciones evolutivas entre la blanco y las homólogas en igual u otras especies
• también permite que los científicos aprendan sobre la forma natural de la blanco en lazo al DCNcA
• el uso de una sonda para la cartografia de un gen o un cromosoma se llama hibridación in situ
  1. los apareamientos de bases de la sonda a la metafasa se separan en una diapositiva de vidrio
  2. la autorradiografía y la tinción de cromosoma o la tinción de cromosoma y la detección de anticuerpo de la fluorescencia revelan qué cromosoma y el área en ese cromosoma a el cual la punta de prueba pegó

Spectral In de Karyotyping (SKY). este procedimiento todos los cromosomas humanos se pintan sobre el genome para proporcionar a un análisis directo e instantáneo de eso condición de los genomes. SKY se utiliza actualmente en el estudio de los tumores y de la citogenética evolutiva - el estudio de las diferencias en la organización del genome humano en otras especies.

Electrofloresis gel separa las macromoléculas (DNA, RNA, proteína) por su carga, talla, y otras características físicas

El Método de Sanger (la secuenciación y el síntesis de DNA) son una manera de marcar síntesis del DNA con el ddATP, el ddGTP, el ddTTP, o ddCTP. Produce la secuencia de los nucleotidos en la muestra.

La reacción en cadena por la polimerasa: un protocolo general a la amplificación rápida in vitro del DNA

1. se apunta una secuencia (nota: el aislamiento no es necesario, ni es la purificación; podía ser cualquier cosa!)
2. La polimerasa de la DNA se agrega a la síntesis iniciada de la DNA, a una fuente del nucleotideo (etiquetada a veces para la microscopia de la fluorescencia), al almacenador intermediario, y a las cartillas que son porciones complementarias químicamente sintetizadas de la DNA de la blanco
3. calor abreviadamente
4. refresqúese para permitir que las cartillas crucen por hibridación a las porciones de la DNA de la blanco
5. La polimerasa de la DNA amplía la cartilla
6. el ciclo relanzó @ aproximadamente 5 min. por borrar

La Transferencia southern

1. preparación del fragmento de la restricción (consiste en a menudo genome entero)
2. electroforesis
3. el borrar: los solos hilos son transferidos a las membranas de nilon o al papel especial por la acción capilar de la nota del gel...: cuando el borrar utiliza la acción capilar se llama Southern Blotting (transferencia southern).
4. hibridación: la punta de prueba radiactiva solo-trenzada de la DNA complementaria al gene del interés es agregada y las fijaciones base-emparejando a similar fragmentos de la restricción en el gel
5. aclaración de exceso de la punta de prueba
6. autoradiografía: la radiactividad expone la película del teh para formar una imagen que corresponda a los fragmentos de la DNA del teh que base-emparejaron con la punta de prueba
7. - el apoyo principal de la investigación de la expresión del gene - trabajos que borran norteños con mRNA.

Analisis RFLP

• los polimorfismos de la longitud del fragmento de la restricción son dfferences en secuencia de la DNA en los cromosomas homólogos que dan lugar a sitios de la restricción que diferencian y a modelos del fragmento de la restricción así que diferencian
• RFLPs se detecta generalmente con borrar meridional
• Puesto que diversas secuencias darían lugar a diversos sitios de la restricción para el mismo enzima(s) de la restricción, diversos resultados del electrophoresis esperan

Nota: Los investigadores reproducen e identifican a menudo genes sin saber su producto.

Mutagénesis In vitro un metodo poderoso

1. las mutaciones alteran a menudo la función del producto de la proteína.
2. cuando un gen transformado se reintroduce a la célula hospedadora, a veces es posible determinar la función de la proteína normal que falta examinando cambios en la fisiología o el modelo de desarrollo.

Un protocolo general

1. plasmida desnaturalizada al 1r hilo
2. apareamientos de bases mutagenicos de la cartilla
3. La polimerasa de la DNA alarga la cartilla
4. Sellos la ligasa de la DNA él
5. el vector mutágeno invade bacterias
6. el mutante del 50 y el normal del 50 permite para que una comparación ayude a identificar la proteína normal

Proyecto del Genomo Humano

1. la cartografia genetica:
   localice 3000 genes (lugares geométricos identificables llamados : marcadoras genéticas) espaciados uniformemente a través de los cromosomas. Es posible debido a tan muchos RFLPs: Las marcadoras de RFLP son marcadoras genéticas
2. la cartografia fisica:
   corta cada cromosoma en fragmentos identificables para determinar su orden por recorrer la cromosoma
   1. sonda enlaza al gen conocido
   2. corta comenzar el DNA con 2 diversas enzimas que crean 2 genotecas
   3. utilice la sonda 1 para defender la genoteca 2 para los fragmentos del DNA que solapan el gen conocido
   4. aísla  el DNA de la copia de la genoteca 2 marcada con marcadora por la sonda y hace una nueva sonda del extremo derecho de la copia marcada con marcadora
   5. sonda 2 criba la genoteca1 para segmentos que solapan
   6. relance los pasos de progresión 4 y 5 con las genotecas que se alternan " para caminar" abajo del DNA original
3. la secuenciación del genomo:
   determina el orden exacto del nucleotido
4. analice los genomos de otras especies para aprender sobre ellas y para desarrollar nuevas estrategias y técnicas para asociar el genomo humano entero

Genetica Comercial: DNA+Industria; Terapia Del Gene; DNA societal, ambiental, y Tecnologia agrícola

DNA y Industria

Un objetivo de los muchos: diagnosticar las enfermedades genéticas antes del nacimiento para prevenir desórdenes genéticos.

Terapia de Genes

Objetivo: substituir un alelo por la recombinación genética. Esto trabaja bien con solas enfermedades de la deficiencia de la enzima. cómo? Pone en médula o quite las células e infectarésos con vectores del retrovirus.
Preguntas: cuándo es la terapia del gene mas eficaz?
Cómo conseguimos el " antídoto " a las áreas problemáticas?
Cómo aseguramos la regulación del gene nuevo?
.... y otras preguntas sociales y éticas.

Vacunas

• El problema y la solución 1 virus puede compararse a muchas enfermedades; por lo tanto con el estudio de un virus él es posible desarrollar muchas vacunas para muchas enfermedades simultáneamente.
• notas: la mayoría de los productos farmacéuticos son hormonas (e.g. insulina) y proteínas (generalmente interferón anticáncer moléculas).
• ejemplos
  1. HGH (hormona humana del crecimiento): trata el hypopituitarism (hypo- menos, producción pituitaria de la glándula del pituitar-).
  2. EPO (erythropoietin): estimula la producción de la célula de sangre roja en médula mientras que origina del riñón; trata anemia.
  3. TPA (activación plasminógena del tejido fino): una manera muy costosa de disolver coágulos de la sangre
• varios otros métodos de luchar genes perjudiciales
  1. ácido nucleic del antisense: una molécula solo-trenzada del RNA o de la DNA que ata al mRNA para bloquear la traducción de genes virulentos o cancerosos
  2. receptor superficial mímico a la trampa una presencia de los virus en el cuerpo

Obtención de la huella genética (fingerprinting) y VNTRs

Obtencion de la huella genetica es análisis de RFLP por electroforesis y autoradiografía. Una parte importante de fingerprinting es el Variable Tandem Number Repeat (VNTR). VNTRs son secuencias microsatelites del DNA en varios lugares geométricos en el genomo humano cuyo número de repeticiones varía dentro de poblaciones humanas. Juntado a veces con PCR, el tándem variable del número relanza - en esta situación - medidas la talla de la DNA basada en los satélites dentro de un fragmento de la restricción.

El ambiente y la tecnología de DNA

Basuras de reciclar y la desintoxicación con los microorganismos que pueden genéticamente ser dirigidos.

La agricultura y la tecnología de DNA

• las herramientas populares en esta área son las adiciones de la celulasa en hormona del crecimiento de la agricultura y de los bóvidos en los ganados y los sectores lecheros
• las granjas ptransgenicas rocuran hacer que su cosecha se convierte más rápidamente con rasgos deseados
• la producción transgenica del organismo es más fácil en plantas porque a menudo una célula de la planta puede crecer en una planta entera
• vector " lo más mejor posible " es la plasmida ti (tumor que induce) de los Agrobacterium tumefaciens. Inserta el DNA en la celula hospedadora para causar tumores; sin embargo, solamente los "dicots" (los árboles con el 2 hojas de germen ) son susceptibles a este vector. En lugar, el arma del DNA descrito previamente y el electroporacion se utiliza para los "monocots" (árboles con 1 hoja de germen).

Después: "Evolución: Nomenclatura"